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最新!复旦姜世勃/NIH陈小元 PNAS:纳米诱饵通过同时吸附病毒和炎性因子抵抗COVID-19

来源:2020-10-13

  106日,国际顶级期刊PNASProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,美国科学院院报)在线发表了由美国国立卫生研究院(NIH)陈小元、复旦大学姜世勃、谢幼华和陆路共同通讯,美国国立卫生研究院(NIHLang Rao、复旦大学夏帅和徐巍共同一作的文章 “Decoy nanoparticles protect against COVID-19 by concurrently adsorbing viruses and inflammatory cytokines”,阐述纳米诱饵通过两步中和作用有效干预病毒感染及其相关的炎性因子风暴等免疫疾病,为新冠肺炎治疗药物的设计提供了全新的策略 

  先说重点: 

  严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2SARS-CoV-2)引起的COVID-19大流行到目前仍无有效的疫苗或药物,这更加凸显了迫切需要快速开发针对这种新兴病毒的治疗策略。在这里,我们通过强大的两步中和方法设计了针对COVID-19的诱饵纳米颗粒:第一步是中和病毒,第二步是中和炎症细胞因子 ─ 白细胞介素6IL-6)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF。通过融合衍生于人髓单核细胞(含有GM-CSF受体的THP-1细胞)的细胞膜纳米囊泡和稳定表达血管紧张素转化酶IIACE2)受体的基因工程细胞(含有GM-CSF受体的293T细胞)制成纳米诱饵。通过与宿主细胞竞争病毒结合,这些纳米诱饵可有效保护宿主细胞免受SARS-CoV-2伪病毒和真病毒的感染。此外,依靠纳米颗粒表面丰富的细胞因子受体,纳米诱饵可有效地结合并中和炎性细胞因子 ─IL-6GM-CSF并显着抑制免疫紊乱和急性肺炎小鼠模型中肺脏的损伤。此项工作为持续的COVID-19和未来的潜在流行病提供了一种简单、安全且强大的抗病毒纳米技术。 

  文章解读: 

  1. 纳米诱饵的制备: 

  科研人员首先通过基因工程制备能表达ACE2(新冠病毒的受体)的293T293T / ACE2)细胞。免疫荧光成像和流式细胞术证实了ACE2能在293T细胞上高效表达。为了提取细胞膜纳米囊泡,科研人员通过低渗裂解、机械破坏和梯度离心的组合先去除细胞内内容物。随后通过一系列超声处理并通过微型挤出机上的纳米孔将细胞膜通过纳米孔挤出,制备了293T/ACE2THP-1的细胞膜衍生的纳米囊泡(即ACE2-VesTHP1-Ves。之后,将ACE2-VesTHP1-Ves混合,超声处理并反复通过纳米孔挤出,以形成纳米诱饵。透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征表明,纳米诱饵是圆形脂质滴,平均大小为100 nm。通过蛋白质印迹分析,研究人员进一步确定了纳米诱饵能够保留负责与病毒和细胞因子结合的关键受体蛋白,包括SARS-CoV-2受体蛋白 ─ ACE2IL-6受体蛋白 ─ CD130GM-CSF受体蛋白 ─ CD116。此外,酶联免疫吸附测定(ELISA)定量了ACE2水平,并证明1μg纳米诱饵含有约140 pg ACE2 

  2. 纳米诱饵抑制SARS-CoV-2伪(假)病毒和真病毒(野生型)的感染 

  确认纳米诱饵的制备成功后,科研人员又测试了纳米诱饵基于伪病毒(PsV)的抗病毒作用。发现PsV感染被ACE2-Ves和纳米诱饵显著抑制,这表明在纳米诱饵表面显示的高水平ACE2可以劫持S蛋白介导的病毒感染。众所周知, SARS-CoVSARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)也依靠人ACE2受体进入细胞。因此,研究人员进一步测试了基于假型SARS-CoVSARSr-CoV的纳米诱饵的抗病毒能力。研究结果表明,纳米诱饵对假型SARS-CoVSARSr-CoV的抑制作用与假型SARS-CoV-2相似,这表明纳米诱饵具有广谱的广谱抗病毒能力。野生型的SARS-CoV-2也用于测试纳米诱饵的抗病毒能力。为此,在存在纳米诱饵的情况下,将猴肾Vero-E6细胞与SARS-CoV-2孵育,并通过免疫荧光评估病毒核蛋白(N蛋白)的表达水平。与PsV感染结果相似,纳米诱饵显示出很强的抗活病毒作用,可明显降低病毒载量。我们用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)进一步检查了上清液中的病毒拷贝数,并证明在用纳米诱饵治疗后,病毒RNA水平以剂量依赖性方式显著降低 

  3. 纳米诱饵可在体外中和炎性细胞因子(in vitro 

  为了探究病毒感染期细胞因子表达紊乱情况,科研人员进一步研究了纳米诱饵结合炎症细胞因子的能力。将含有已知初始浓度的IL-6GM-CSF的溶液与诱饵纳米颗粒一起孵育,去除纳米颗粒后,通过ELISA定量上清液中的残留细胞因子。得益于纳米诱饵上丰富的细胞因子受体,研究人员证明了20μg纳米诱饵去除了约160 pg IL-6和约25 pg GM-CSF,这表明纳米诱饵有望有效地抑制TNF-α引起的细胞因子风暴COVID-19与肺部感染和损伤密切相关,后者可能触发炎性细胞因子的产生,导致巨噬细胞/单核细胞募集增强,进而加剧炎性反应。然而,由于缺乏ACE2THP-1细胞对SARS-CoV-2的渗透性不高。为了模拟感染引起的炎症状态,科研人员使用脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞上调炎症细胞因子。LPS处理后,IL-6GM-CSF的水平均显着升高,证实了该模型中激活的炎症反应。然后,科研人员基于此模型测试了纳米诱饵的细胞因子中和性能,发现用纳米诱饵治疗后,IL-6GM-CSF的蛋白水平显著降低,表明活化的炎性因子得到有效干预 

  4. 纳米诱饵在体内抑制急性肺炎(in vivo 

  在确认了纳米诱饵在体外的细胞因子中和能力后,科研人员进一步地检测了纳米诱饵的体内有效性。首先,通过鼻道吸入的方式将荧光标记的纳米诱饵施用于小鼠,以确定纳米诱饵在体内的生物分布。即使在72小时后,单剂量的纳米诱饵也显示出在肺中的出色滞留性,这表明纳米诱饵的下游吸入递送对于体内细胞因子的中和具有潜在作用。随后,科研人员在急性肺部炎症(ALI)小鼠模型上测试了纳米诱饵的体内性能。为了诱导ALI,科研人员首先使小鼠于气管内(intratracheally, i.t.)吸入LPS。在BALF中,LPS攻击后IL-6GM-CSF水平显着升高,表明肺部出现严重的炎症状态。随后的实验结果显示,纳米诱饵接种组有效地降低了BALF中的IL-6GM-CSF的总蛋白水平,表明纳米诱饵具有很强的广谱炎性细胞因子的中和作用。此外,在LPS攻击后24小时,安乐死所有小鼠进行组织学检查。LPS攻击的小鼠的肺部观察到肺泡壁增生,肺泡腔消失,血管扩张和充血以及肺泡炎性细胞浸润,证实了在此ALI模型中严重的肺损伤现象而纳米诱饵组以剂量依赖的方式显著抑制或缓解了肺损伤,表明纳米诱饵在抑制COVID-19相关的免疫紊乱和肺损伤中具有潜在的治疗或缓解作用 

  总结: 

  不难发现,此研究为防控新冠肺炎感染提出了新型的药物设计思路,在干预病毒感染的同时,中和验证细胞因子,进一步缓解由细胞因子风暴引起的免疫紊乱。同时,此纳米诱饵颗粒具有较广谱的冠状病毒中和作用,可抗击于多种使用ACE2作为入侵受体的冠状病毒,且无生物毒性,为新型抗新冠病毒药物的设计提供了独特的解决方案。 

  

   (来源:生命科学前沿) 

  原文出处:Lang Rao, Shuai Xia, Wei Xu, et al. Decoy nanoparticles protect against COVID-19 by concurrently adsorbing viruses and inflammatory cytokines[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences. Oct 2020, 202014352; DOI: 10.1073/pnas.2014352117 

  链接:https://www.pnas.org/content/early/2020/10/05/2014352117