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Science | 施一/高福团队揭示猴痘病毒聚合酶全酶工作的分子机制
猴痘是由猴痘病毒引起的人畜共患病毒性疾病，多年来主要在非洲地区流行，在世界其他地区只有零星感染病例。自2022年5月起，全球多个非流行国家如英国、西班牙、美国等国相继发现猴痘确诊病例，且出现了人际传播，病例数量大幅增加，引起了国际关注。2022年7月23日，世界卫生组织宣布猴痘疫情为全球突发公共卫生事件，目前已造成82000多人感染。9月16日，我国重庆市确诊1例境外输入猴痘病例，引起国内普遍关注。猴痘病毒属于被科学家长期忽视的传染性病原，因此迫切需要加强针对猴痘病毒的基础研究，为有效预防和治疗猴痘提供重要的理论基础。
猴痘病毒属于痘病毒科，正痘病毒属，基因组为闭合的双链线性DNA。与同为正痘病毒属的痘苗病毒和天花病毒一样，猴痘病毒在宿主细胞的细胞质中形成复制工厂进行基因组复制，产生无分支的首尾相连的DNA多串联体，之后在解离酶的作用下分解成单个病毒基因组。在进行DNA基因组合成时，至少需要8种病毒蛋白相互合作才能完成整个过程。其中由聚合酶F8，可持续因子E4和A22异二聚体组成的聚合酶全酶复合物是病毒复制机器的核心组成部分，直接负责合成子代DNA，是理想的抗病毒药物开发靶点。过去对痘苗病毒复制机制的研究，让我们对于正痘病毒的基因组复制过程有了初步了解，但是正痘病毒聚合酶全酶复合物的高分辨结构以及基因组可持续合成的分子机制仍有待深入研究。
2022年12月15日，Science杂志上在线发表中国科学院微生物研究所施一/高福院士团队的研究成果：Structure of monkeypox virus DNA polymerase holoenzyme，揭示了猴痘病毒聚合酶全酶工作的分子机制。
研究人员利用冷冻电镜技术解析了猴痘病毒核心聚合酶全酶复合物处于复制构象时的高分辨率三维结构。结构分析发现猴痘病毒聚合酶全酶复合物包含一个F8亚基，一个A22亚基，一个E4亚基，一条双链DNA（dsDNA）和一个处于酶活中心的dTTP底物分子。F8亚基和E4亚基的结构与痘苗病毒中相对应的蛋白结构非常相似，具有典型的DNA聚合酶和尿嘧啶糖苷水解酶特征。A22亚基属于痘病毒特有的蛋白，可以分为N端结构域 （A22-NTD），中间结构域（Mid）和C端结构域（A22-CTD）。其中A22-NTD和A22-CTD分别与E4和F8结合，起到中间桥梁的作用（图1）。通过结构比对分析发现，Mid结构域具有典型DNA连接酶催化结构域折叠特征，但是不能发挥类似T4连接酶活性的功能。因此，推断A22可能是一个退化的连接酶，用于连接全酶复合物中的F8和E4亚基蛋白。
图1：？痘病毒DNA聚合酶全酶复合物的整体结构
猴痘病毒聚合酶和dsDNA的结合模式与其它B家族DNA聚合酶非常相似，说明其在进化上具有一定的保守性。与未结合DNA的痘苗病毒聚合酶结构比较分析发现，处于复制构象的猴痘病毒聚合酶的手指结构域进行了~17°的旋转，更靠近手掌结构域，同时使得两个带正电的氨基酸残基与dNTP的三磷酸基团相互作用，促进聚合反应的进行。拇指结构域也发生了巨大的构象调整，利用带正电荷的凹槽来结合与稳定dsDNA。聚合酶蛋白主要与DNA的磷酸骨架相互作用，与碱基之间的相互作用非常少，这也保证了复制过程中不受DNA序列组成的影响，使得延伸过程得以顺利进行（图2）。
图2 ：猴痘病毒聚合酶的构象变化
此前研究表示B家族DNA聚合酶在进行DNA合成时，一般是通过增殖细胞核抗原（PCNA）或PCNA类似蛋白与产物dsDNA相互作用提升聚合酶的可持续合成能力。猴痘病毒却并不编码PCNA类似的蛋白，而是通过A22-E4形成的异二聚体来保证可持续合成能力。之前针对痘苗病毒的研究认为可持续合成因子蛋白呈细长形，聚合酶和尿嘧啶糖苷水解酶之间没有相互作用，两个酶的活性中心相距~150 ？。而在该研究团队解析的聚合酶全酶复合物结构中，E4尿嘧啶糖苷水解酶与F8聚合酶直接相互作用，并与聚合酶的N端结构域（NTD）和外切酶结构域组成一个闭合的模板进入通道，形成“前置滑动夹”（forward sliding clamp），防止模板DNA从蛋白复合物上解离下来，从而增加可持续合成能力。相比于其它已知的B家族聚合酶结构，它们的模板进入通道是由NTD和外切酶结构域形成的开放的结构，并不能很好的固定模板。而PCNA三聚体形成一个闭合环，dsDNA产物从中间穿过，形成一个“后置滑动夹”（backward sliding clamp）来增加可持续合成能力（图3）。该研究首次解析了猴痘病毒聚合酶全酶复合物处于复制构象时的结构，阐明了痘病毒DNA复制的工作机制，揭示了其特殊的可持续合成能力的作用模式，极大促进了人们对于痘病毒基因组复制过程的了解，为后续抗病毒药物的开发提供了关键结构基础。
图3：猴痘病毒聚合酶独特的可持续合成机制
中国科学院微生物研究所研究人员彭齐、清华大学医学院基础医学系博士生谢宇锋和中国科学院微生物研究所工作人员蒯璐为本文共同第一作者，研究人员齐建勋、王寒也参与了该研究课题。
（来源：BioArt）
原文出处：Peng Q, Xie Y, Kuai L, Wang H, Qi J, Gao GF, Shi Y. Structure of monkeypox virus DNA polymerase holoenzyme. Science. 2022 Dec 15:eade6360. doi: 10.1126/science.ade6360. Epub ahead of print. PMID: 36520947.