乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）如未经过规范的治疗，可发展为肝硬化甚至肝癌，是严重危害人类健康的公共卫生问题。乙肝病毒的持续性感染最重要“推手”是其共价闭合环状DNA（covalent closed circular DNA，cccDNA），目前的抗病毒药物均无法靶向cccDNA将其清除。袁正宏课题组在2021年通过高灵敏荧光原位杂交（FISH）揭示了HBV 感染肝细胞的核酸动力学及细胞核内病毒cccDNA的表观遗传学特性，以“定格动画”的方式给cccDNA做了“画影图形”（PLoS Pathog. 2021 Aug 9;17(8):e1009838）,但该技术无法获得cccDNA在活细胞内的时空动态信息。而本项研究第一次给cccDNA拍摄出“IMAX电影”，成为研究其活细胞动态的利器。 

　　

　　乙肝病毒的基因组微小（约3200碱基对），编码基因紧凑，同一段DNA序列可编码多种不同蛋白，甚至还带有很多顺式作用元件，对其进行基因工程改造，且不影响病毒复制难度极大。为实现对cccDNA的实时成像，攻关小组巧妙地结合CRISPR-Tag DNA成像技术和重组cccDNA技术，实现病毒复制无损前提下对乙肝病毒基因组的改造，使得病毒基因组DNA含有一个拷贝的CRISPR-Tag；在特定sgRNA (small guide RNA) 的引导下，可高效招募数十个融合绿色荧光蛋白的dCas9（dCas9-GFP），实现对含有CRISPR-Tag序列的cccDNA进行单拷贝精度的细胞内示踪。通过不断优化，该系统成功在细胞核内检测到cccDNA的点状信号（图1A），并利用DNA FISH和RNA FISH验证了活细胞标记的有效性和特异性（图1B）。 

　　

　　图1 HBV cccDNA活细胞成像系统的设计原理 

　　建立cccDNA活细胞成像技术为解开乙肝病毒的一些不解之谜提供了有效的工具。研究表明，虽然cccDNA在肝细胞内较为稳定（课题组通过动物模型估测得到的半衰期约为8周 ），但在宿主细胞快速增殖条件下，病毒却无法维持在子代细胞的感染。这提示cccDNA在细胞有丝分裂后有被丢失的倾向。但囿于实验体系的限制，一直缺乏直接的证据分析cccDNA在有丝分裂前后的命运。对rcccDNA的细胞内活细胞动态观察和随后的统计学分析显示，在细胞分裂时cccDNA不黏附在染色体上，不发生扩增，大约80%的cccDNA在一轮有丝分裂过程中丢失，剩余的cccDNA被随机分配到子代细胞中（图2）。于此截然相反的是，卡波齐肉瘤疱疹病毒（Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV）的DNA在有丝分裂过程中黏附于宿主染色体，在有丝分裂过程后大部分被保留（图3），这一现象与前人报道一致。 

　　

　　图2 rcccDNA在细胞分裂时的动态 

　　

　　图3 KSHV来源的质粒在细胞分裂时的动态 

　　利用该体系还获得一些意外的收获。在对rcccDNA的各种失活突变体的观察发现，在无HBx表达情况下，dCas9-GFP标记cccDNA的效率大大下降，该现象可通过外源回补HBx得以逆转（图4）。这提示HBx缺失或可降低cccDNA微染色体的可接近性，从而降低了荧光成像效率。基于此，该系统或可作为研究HBx调控cccDNA微染色体“打开”与“关闭”的有力工具。 

　　

　　图4 HBx表达对CRISPR-Tag可及的cccDNA数量的影响。（A）HBx缺失（第二行）的rcccDNA与野生型（第一行）相比核内荧光点数明显降低，而补偿HBx表达后（第四行），光点数得以恢复。(B)荧光点数统计分析结果。 

　　综上所述，本文构建了研究乙肝病毒cccDNA的新工具，首次实现了cccDNA的活细胞可视化和实时追踪，进一步加深了对cccDNA生物特性的认知，并为开发新的抗病毒策略和药物提供了新的理论基础和技术支撑。尤为值得关注的是cccDNA新的动态生物学特征：一轮的细胞分裂即可导致cccDNA的大量丢失，分裂后存活的cccDNA分子将随机分配到两个子代细胞中。有丝分裂后cccDNA不稳定的结果表明，如果病毒阳性细胞被抗原特异性免疫应答靶向并伴有肝细胞更新，则治愈的机会更大。此外，旨在预防HBV再感染和/或最大限度地抑制或淬灭残余病毒DNA合成和核循环的治疗方法可能会进一步加快cccDNA库的清除。 

　　该研究得到了国家自然科学基金重大研究计划、国家科技重大专项、广东省珠江人才计划地方创新团队项目、中国医学科学院医学创新基金、上海市科委基础研究重大专项的资助。此次发表的研究论文，丁家惠为第一作者，袁正宏研究员和张小楠研究员为共同通讯作者。易志刚、宰文静、邬敏、陈宝惠和蔡启良等也为该研究做出了重要贡献。 

　　

   （来源：生命科学前沿） 

　　原文出处：Ding J, Yi Z, Zai W, Wu M, Chen B, Cai Q, Zhang X, Yuan Z. Illuminating the Live-Cell Dynamics of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Using the CRISPR-Tag System. mBio. 2023 Feb 22:e0355022. doi: 10.1128/mbio.03550-22. Epub ahead of print. PMID: 36840581. 

  链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36840581/